當在內皮細胞上接種到類似基底膜的表面時，它們在體外形成類似毛細血管的結構，再現了血管生成的過程。這種管形成實驗被用作血管生成的體外模型系統，以研究特定物質的促血管生成或抗血管生成效果。
Matrigel®是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的，并作為標準的基底膜樣（BM）表面。然而，Matrigel®的一個缺點是其多種BM蛋白的成分定義不清且可變。這導致不同批次之間的機械和生化性質波動，阻礙了可靠的重現性和可比性。
µ-Slide 15 Well 3D的示意圖。ibidi 的“孔中孔” 技術避免了凝膠彎液面的形成，從而形成了一個平坦的細胞生長區域.
本實驗應用描述了一種使用層粘連蛋白-I型膠原凝膠（代替Matrigel®）在µ-Slide 15 Well 3D中進行管形成試驗的實驗方案。這種定義明確的雙組分層粘連蛋白-I型膠原凝膠能夠可靠地重復形成類似毛細血管的結構，可以作為Matrigel®的替代品。本應用不討論凝膠之間差異的詳細分析。欲了解更多信息，請閱讀相關文件和文獻。
相關文獻：
•Rüdiger D, Kick K, Goychuk A, et al. Cell-Based Strain Remodeling of a Nonfibrous Matrix as an Organizing Principle for Vasculogenesis. Cell Rep.2020 Aug 11; 32(6):108015.doi:10.1016/j.celrep.2020.108015.
1、材料
1.1.試劑和緩沖液
• 人臍靜脈內皮細胞（HUVEC, C-12203, PromoCell）
• 內皮細胞生長培養基（C-22010, PromoCell）
• Collagen I, Rat Tail, 非胃蛋白酶化，5 mg/ml（50201, ibidi）
• Collagen I, Bovine, 非胃蛋白酶化，5 mg/ml（50301, ibidi）
• Cultrex 3-D 培養基質層粘連蛋白I 6 mg/ml（3446-005-01, R&D Systems）
• 10x PBS（70011-044, Gibco）
• NaOH在超純水中，1.25 M和7 M
• 乙酸，0.1 M和17.5 mM
1.2.設備
• µ-Slide 15 Well 3D, ibiTreat（81506, ibidi）
• µ-Slide Rack 載玻片支架（80003, ibidi）
• 用于檢查凝膠體積的刻度紙
• 冰和冷卻架
• 標準細胞培養設備（移液器、試管、無菌工作臺、細胞培養箱、培養瓶、血球計數器等）
• 倒置顯微鏡
• 可選：多通道移液器
2.制備3D凝膠
在無菌條件下執行以下所有實驗步驟。
可以使用Collagen Type I, Rat Tail 或 Collagen Type I, Bovine來制備層粘連蛋白-I型膠原凝膠。對于兩者，首先必須制備4 mg/ml的I型膠原凝膠（見2.1）。
關于移液凝膠的重要注意事項
始終使用預冷的吸頭（4°C）來移液凝膠。
由于層粘連蛋白和I型膠原的高粘度，建議在所有涉及層粘連蛋白和I型膠原的步驟中使用反向移液。將移液管壓至第二個壓力點并完全填充吸頭。只在達到第一個壓力點時才分配凝膠。這會在吸頭中留下一定量的凝膠殘余物，但體積更準確。或者，您可以使用專為高粘度溶液設計的移液管。我們推薦使用Eppendorf Visco Tips或Gilson Microman E等產品。
請注意，即使在4°C下，凝膠混合物至多只能在部分凝膠化前使用5分鐘。
1.實驗前一天，將層粘連蛋白放在冰箱中的冰上于4°C緩慢解凍過夜。按照說明書制備I型膠原。
2.在實驗當天，將所有用于凝膠的材料和足夠容量的無菌管放入層流罩內的冷卻架上。在制備凝膠期間，始終將材料和凝膠放在在冷卻架上。
2.1.制備I型膠原凝膠
關于I型膠原濃度的重要說明
由于批次特定的偏差，瓶中的I型膠原蛋白濃度可能會有所不同。
在制備工作溶液4 mg/ml之前，將I型膠原調整為4.5 mg/ml的儲備溶液。
在CoAtab的I型膠原蛋白產品頁面上查看單個批次特定膠原蛋白濃度的分析證書（CoA）。
1.稀釋前，必須通過上下移液幾次積極混合瓶中的原始I型膠原凝膠。這確保創建了均勻的溶液。
制備I型膠原儲備溶液
2.將I型膠原稀釋至4.5 mg/ml。對于Collagen Type I, Rat Tail，使用17.5 mM乙酸，對于Collagen Type I, Bovine，使用0.1 M乙酸。在分析證書（CoA）中找到單個批次特定的I型膠原蛋白濃度。
制備4 mg/ml I型膠原工作溶液
3.按照下表中列出的順序，將所有成分（除了I型膠原）移液到一個預冷的管中。在保持管子在冷卻架中的同時徹底混合。
4.將膠原儲備溶液加入混合物中，得到工作溶液為4 mg/ml。在保持管子在冷卻架中的同 時，通過移液徹底混合。
使用預稀釋的4.5 mg/ml Collagen I, Rat Tail （左側）或Collagen I, Bovine （右側）的儲備溶液，配制4 mg/ml Collagen I工作溶液的移液方案。請注意，為了正確設置pH值，對于Collagen I, Rat Tail（左側）使用1.25 M NaOH溶液，而對于Collagen I, Bovine （右側）使用7 M NaOH溶液。所有成分按移液順序列出。濃度的差異用藍色突出顯示。
2.2.制備層粘連蛋白-I型膠原凝膠
1.層粘連蛋白與I型膠原的混合比例為4:1（例如，將400 µl層粘連蛋白與100 µl I型膠原工作溶液混合）。
2.在保持管子在冷卻架中的同時，通過移液徹底混合。現在凝膠已準備好可以移液到µ-Slide 15 Well 3D的內孔中（見2.3）。
2.3.凝膠應用
1.在層流罩中放置一個µ-Slide支架。從無菌包裝中取出µ-Slide 15 Well 3D并將其放在µ-Slide支架上。
2.在µ-Slide下方的罩子中放入一張刻度紙以調整體積。確保載玻片和刻度紙之間的距離約為1-2厘米。
3.始終使用預冷的吸頭（4°C）來移液凝膠。
4.為了避免凝膠中出現氣泡，請確保在填充到孔中之前凝膠溶液已經充分混合。因此，在將吸頭留在凝膠中時，用移液器（10 µl）進行三次上下移動。
5.向µ-Slide 15 Well 3D的每個內孔加入10 µl的凝膠。將移液器吸頭直立保持在孔的中間，以防止凝膠泄漏到上部孔中。
6.用蓋子蓋住µ-Slide載玻片。
µ-Slide 15 Well 3D 放在帶有刻度紙的µ-Slide支架上，用于調整凝膠體積。
調整凝膠體積
無凹凸的凝膠表面對于出色成像至關重要。為了實現這一點，每個內孔的凝膠體積必須精確為10 µl。由于凝膠的高粘度，可能需要將移液器調整到大于或小于10 µl。
要準確調整凝膠體積，請將載玻片放在µ-Slide支架中的刻度紙上方1-2厘米處。現在將移液器調至10 µl并將凝膠填充到一個內孔中。通過填充的孔觀察紙上的標記。如果可以看到放大或縮小效應，則以±1 µl的步驟改變體積，直到你不再觀察到放大效應為止。
如果刻度紙的網格看起來較小，則必須增加移液量。如果網格放大了，則必須減少移液量。
凝膠體積不足會導致刻度紙網格的外觀變小，而過量的凝膠體積則會使刻度紙網格的外觀增大。
2.4.凝膠化
1.準備一個浸有水的紙巾的培養皿作為濕度室。2. 將µ-Side放入培養皿中并蓋上蓋子。
3.為了聚合，將整個組件放入培養箱中60分鐘。
4.同時，準備細胞懸浮液（見3）。
µ-Slide 15 Well 3D 在濕度室中進行凝膠聚合。
3.細胞接種
凝膠表面接種的細胞數量是獲得管形成測定可靠結果的關鍵參數。細胞數量的偏差會強烈影響管狀網絡的形成。細胞類型和大小決定了細胞接種數量，并且在開始一系列實驗之前必須進行優化。HUVEC應使用低代數（至多到P6）。
在整個操作過程中迅速工作以防止孔干燥是非常重要的。除非另有說明，否則所有給出的體積均為每個孔體積，所有孵育步驟均在室溫下進行。
1.收獲HUVEC，離心，并在少量的培養基中稀釋細胞沉淀（取決于所需的細胞濃度）以進行計數。
2.計數細胞。計數應盡可能準確，并且始終以相同的方式執行，以便在所有孔中都有相同數量的細胞。對于每個孔5000個細胞的細胞數，調整它們在培養基中的濃度為1 x 105個細胞/ml。
3.從培養箱中取出裝有聚合凝膠的µ-Slide 15 Well 3D，并將其放在層流罩下的µ-Slide支架上。
4.在將細胞懸浮液加入孔中之前，通過多次上下移液徹底混合。向每個上部孔加入50 µl。保持移液器吸頭直立，不要用移液器吸頭觸碰凝膠。在此步驟中使用多通道移液器可能很有幫助。
5.用提供的蓋子蓋住µ-Slide。可選地，可以使用ibiSeal 22 x 48(10872)，一種自粘性蓋膜，覆蓋孔以改善相差顯微鏡觀察
6.µ-Slide 15 Well 3D現在已經準備好進行觀察。細胞將通過被動沉降過程沉積到凝膠表面頂部。隨后，管形成開始，可以在一個焦平面上成像且無彎液面。
使用多通道移液器將細胞移入µ-Slide 15 Well 3D中
(A) 細胞的被動沉降過程。幾分鐘后，所有細胞都位于底部。
(B) µ-Slide 15 Well 3D中管形成的示意圖（僅顯示了凝膠上帶有細胞的內孔）。
4.圖像采集
管形成可以使用明場、相差或熒光顯微鏡成像（例如，使用活細胞染料如鈣黃綠素染色時）。
顯微鏡上的數據采集可以手動或自動進行。特別是當首次進行管形成測定實驗時，我們建議通過錄制延時視頻來自動采集數據，以確定時間依賴性和曲線特征（例如，較大值和穩定相位）。在后續實驗中，單次手動測量通常足以研究物質對管形成的影響。
對于HUVECs，我們建議使用4倍或10倍放大，并在至少5小時內每5分鐘拍攝一次單個幀。為了量化管形成，可以根據不同的參數分析圖像，如管長度、環路、細胞覆蓋面積或分支點。
5.結果
大鼠尾部和牛層粘連蛋白-I型膠原凝膠均能誘導管狀網絡的形成。2小時后，管、環和分支點將可見。與Matrigel®相比，網絡的結構和網絡形成的動態有所不同。本應用說明中不討論凝膠之間的差異及其原因的進一步詳細分析。然而，兩種凝膠都可以用來研究特定物質的促血管生成或抗血管生成作用對管形成網絡可檢測關鍵參數的影響。
µ-Slide 15 Well 3D中使用HUVECs進行管形成測定的延時圖像。在Matrigel®（左側）、層粘連蛋白-I型膠原大鼠尾部凝膠（中間）和層粘連蛋白-I型膠原牛凝膠（右側）上，接種細胞0小時、2小時、4小時、6小時和24小時后的相差顯微鏡觀察，使用4倍物鏡。
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