前言

　　本應用說明介紹了一種在µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern ibiTreat(cir200. pit600. hex)微圖案六通道載玻片上培養、固定及染色細胞或細胞球狀體的簡單方案。ibidi µ-Patterns在ibidi Polymer聚合物蓋玻片上提供空間定義的ibiTreat(組織培養處理)粘附微圖案區域，周圍區域環繞著生物惰性Bioinert(ULA)，以確保細胞僅在定義的微圖案區域形成3D聚集體。

　　在此示例中，人肝細胞(Huh7)培養在多細胞陣列上，并用福爾馬林溶液固定，F-肌動蛋白細胞骨架、α-微管蛋白和細胞核被標記用于熒光顯微鏡觀察。

　　1. 實驗材料

　　1.1 試劑與緩沖液

　　* 貼壁細胞，例如Huh-7(JCRB: #JCRB0403)

　　* 細胞培養基;例如，含10%胎牛血清(Gibco,10270106)的基礎培養基RPMI-1640(Gibco,11875093)

　　* 磷酸緩沖鹽溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* Accutase(A11105.Gibco)，或其他適合用于細胞收集的解離試劑

　　* 磷酸緩沖鹽溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* 福爾馬林，10%，即用型(HT5011.Sigma Aldrich)

　　* Triton-X-100(A16046.Thermo Fisher Scientific)

　　* 透化緩沖液(含0.5% Triton-X-100的PBS)

　　* 牛血清白蛋白(BSA)(A1470-10G,Sigma Aldrich)

　　* 封閉緩沖液(含1% BSA的PBS)

　　* 抗體稀釋緩沖液(1% BSA和0.05% Triton-X-100溶于PBS)

　　* 鬼筆環肽-iFluor 488(ab176753.Abcam)

　　* 單克隆抗-α-微管蛋白抗體(T5168.Sigma-Aldrich)

　　* 抗小鼠IgG-Atto 594二抗(76085.Sigma-Aldrich)

　　* 含DAPI的ibidi封片劑(50011.ibidi)

　　* ibidi浸油2(50102.ibidi)

　　1.2 設備

　　* µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat, cir200. pit600. hex} (83612. ibidi)

　　* µ-Slide Rack 載玻片支架(80003. ibidi)

　　* 標準細胞培養設備(移液器、無菌工作臺、細胞培養箱、培養瓶、細胞培養基、血細胞計數板等)

　　* 具有相應濾光片組的倒置熒光顯微鏡

　　2. 實驗步驟

　　2.1 細胞接種與培養

　　操作µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 前請閱讀說明書。所有步驟均需在無菌條件下進行。建議在接種細胞前一天將載玻片和細胞培養基置于培養箱中，以避免操作過程中產生氣泡。在實驗開始前，請將Huh-7細胞接種于標準細胞培養瓶(例如T75培養瓶)中，使細胞貼壁生長于瓶底。實驗當天，細胞應處于亞匯合狀態且狀態良好。

　　整個操作過程中需快速進行，以防止細胞干燥。

　　除非另有說明，所有提及的體積均指每通道所需體積，所有孵育步驟均在室溫下進行。

　　* 向T75培養瓶中加入10 ml Accutase用于細胞解離;在培養箱中(37 °C，5 % CO?)孵育5分鐘。

　　* 收集細胞懸液，離心，并用少量細胞培養基稀釋以進行計數。

　　* 計數細胞，并用細胞培養基調整至最終濃度為0.5–3 × 106個細胞/毫升。

　　注意：根據所使用的細胞類型和實驗需求優化細胞接種濃度。如需進一步了解影響細胞在ibidi µ-Patterns上附著的重要參數，請點擊查看

　　Application  Note  65:  Cell  Adhesion  on  ibidi  µ-Patterns: Parameters and Optimization.

　　* 拆開µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 載玻片，將其放置在µ-Slide載玻片支架或適當的表面上。

　　* 用移液器直接將30 µl細胞懸液加至每個通道中。快速加樣有助于避免氣泡滯留。對所有通道重復此操作。

　　* 如有必要，通過傾斜µ-Slide并輕敲其一側邊緣，去除通道中滯留的氣泡。

　　* 用隨附的蓋子蓋住儲液池。

　　* 將載玻片連同支架放入培養箱(37°C，5% CO²)中，讓細胞貼壁1小時。

　　* 向每個儲液池中加入60 µl無細胞的細胞培養基。避免氣泡滯留。

　　* 將載玻片連同支架放入培養箱(37°C，5% CO²)中，將細胞培養過夜。

　　* 如有必要，次日可用無細胞培養基洗滌以去除未貼壁的細胞和碎片。

　　* 對于長期細胞培養，建議每1-2天進行一次持續的培養基更換(見本文2.2 通道中的洗滌與持續培養基更換 )。在本示例中，細胞在圖案上培養了10天。

　　2.2 通道中的洗滌與持續培養基更換

　　* 小心移除儲液池中的培養基。吸液時遠離通道，以防將通道內的液體一并吸出。

　　* 輕柔地將120 µl無細胞培養基加入一個儲液池，以補充通道中的培養基。

　　* 吸出對側儲液池中的舊培養基。使用細胞培養吸液裝置時需格外小心，以免沖走部分已貼壁細胞或細胞團。

　　* 每個儲液池使用60 µl無細胞培養基進行補液。

　　Huh-7細胞在六通道載玻片ibiTreat µ-Pattern (200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)上培養10天后的相差顯微鏡圖像。比例尺=100 µm

　　2.3 固定、透化與封閉

　　* 所有步驟需快速進行，以確保通道不會干燥。吸液時避免直接從通道中吸取，以防將通道內的液體吸走。為實驗準備足量的透化緩沖液和封閉緩沖液。

　　* 通過持續培養基更換，用PBS替換細胞培養基進行洗滌(見本文2.2 通道中的洗滌與持續培養基更換)。

　　* 吸出儲液池中大部分PBS。切勿將整個通道內的液體全部吸干。

　　* 用100 µl福爾馬林(10%)固定細胞20分鐘。

　　* 通過持續培養基更換，用200 µl PBS洗滌細胞兩次。

　　* 吸出儲液池中的PBS。注意不要將通道內的全部液體吸干。

　　* 向其中一個儲液池中加入100 µl透化緩沖液，孵育細胞5分鐘。

　　* 通過持續培養基更換，用200 µl PBS洗滌細胞兩次。

　　* 吸出儲液池中的PBS。注意不要將通道內的液體全部吸干。

　　* 用100 µl封閉緩沖液在室溫下封閉20分鐘。

　　* 按照前述步驟，用200 µl PBS洗滌細胞兩次。

　　2.4 染色

　　* 在抗體稀釋緩沖液中稀釋鬼筆環肽和抗-α-微管蛋白抗體(均按1:500稀釋，或根據制造商的建議)制備一抗染色液。

　　* 通過持續更換，用100 µl一抗染色液替換通道中的封閉緩沖液，然后在避光條件下孵育過夜。

　　* 按照前述步驟用PBS洗滌兩次。

　　* 在抗體稀釋緩沖液中稀釋二抗(1:500.或根據制造商的建議)制備二抗染色液。

　　* 用100 µl二抗染色液替換通道中的PBS，并在室溫避光孵育1小時。

　　* 用PBS洗滌三次。

　　2.5 封片

　　* 吸出所有PBS(此時可吸走整個通道內的液體!)，并立即加入含DAPI的ibidi封片劑(ibidi Mounting Medium With DAPI)進行細胞核染色，直至通道充滿。如果使用其他封片劑，請注意其必須為非干燥型，以避免損壞µ-Slide載玻片。

　　* 避光于4 °C保存直至成像。

　　* 染色后的µ-Slide可保存長達4周。但建議盡快進行成像，因為存放時間過長可能會降低圖像質量。

　　2.6 成像

　　* 使用配備適當濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞，必要時可滴加ibidi浸油。

　　* 可選：疊加通道圖像以生成合并圖像。

　　3. 實驗結果

　　Huh-7細胞在µ-Slide VI _0.4六通道載玻片中，貼附于ibiTreat µ-Pattern(200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)微圖案表面的寬場熒光顯微鏡圖像。F-肌動蛋白細胞骨架通過鬼筆環肽(綠色)進行可視化。細胞核用DAPI染呈藍色，微管蛋白呈紅色。成像在尼康TiE倒置顯微鏡上使用4倍物鏡進行。比例尺=100 µm。